- SOD粗品和精品是如何区分的SOD有粗品和精品之分,请问将其分为
- SOD有粗品和之分,请问将其分为粗品和精品的依据是什么?产品质量有什么技术指标要求?另外"SOD收率"指的是什么意思？
- SOD精品一般是把SOD产品经过柱层析,柱层析后的SOD没有小分子等杂质, 层析后为高活性的SOD大分子.SOD精品价格更高,它主要作为生物试剂, 化验室标准试剂试用.目前SOD柱层析有两种,二者可单独使用,也可结合使用,一般是DEAE-- 纤维素层析和SephadcxG--100葡聚糖凝胶层析,将(二)2,热变性后SOD丙酮沉淀用PH7.6,0.2MNaH2PO4-NaHPO4缓冲溶液溶解,有不溶的杂蛋白时.离心抛去沉淀,上清液上DEAE--纤维素或SephadsxG--100层析柱(1*20cm或2.5*30cm),梯度洗脱 , 洗脱液为PH7.6,0.2M,NaH2PO4--NaHPO4缓冲液,下流速度控制在0.2--0.5ml/min,在分光光度计上用紫外谱325nm处测流出液,合并活力峰,再用蒸馏水反复透析,透析彻底后, 放入样品皿置于冷冻干燥机中干燥后即得SOD精品.
一.主要设备:(1)工业用离心机一台;(2)恒温水浴锅(10L--50L)(可自制)1台;(3)冰柜1台;(4)搅拌机1台;(5)玻璃器皿:1000ml,500ml烧杯各3只,50ml烧杯 2 只,50ml,500ml量杯各1个;(6)塑料桶若干个。
二.主要试剂:(工业纯度)柠檬酸钠,柠檬酸,葡萄糖,乙醇90%，氯仿,丙酮,氯化钠,磷酸氢二钠,磷酸二氢钠,去离子水或蒸馏水,葡萄糖凝酸胶SephadexG-- 100 和DEAE--纤维素.
三.试剂的配制:
1.抗凝剂配方:(1)柠檬酸钠30g,柠檬酸10g葡萄糖 25g加水至1升,一般此种是每7ml血液,加1ml(抗凝剂).(2)40g/升柠檬酸钠溶液:在1升水中加入0.9克的氯化钠.
2.生理盐水:(0.9%)在91克水中加入0.9克的氯化钠.
3.磷酸盐缓冲溶液的配制:PH7.6,0.2M磷酸盐缓冲溶液,一般用Na2HPO4.H2O,35. 61 克 / 升和NaH2PO4.2H2O 31.21克/升,前者加87.0ml,后者加13.0ml混合后即为PH=7.6 缓冲溶液,如果用K2HPO4.3H2O为45.644g/升,NaH2PO4.2H2O为31.21克/升,仍是前者87.0ml,后者13.0ml混合后即得.
4.冷却剂:在本工艺中有使用-15度低温,一般用如下配方:用33克食盐加入100克雪或碎冰,以此比例配成混合体可达-21.3度。
四.工艺流程
(一)除血红蛋白
1.血液抗凝处理,在新鲜牛,马,猪血中迅速加入ACD1号抗凝剂,并缓慢搅匀,每7毫升血液中加入抗凝剂1毫升或2号抗凝剂.
2.把抗凝处理的血液放入离心机,以3000r/min离心约15--20分钟, 用吸管把上清液(黄色血清)小心吸去抛掉,下层的红血球用2--3倍生理盐水洗2--3次,在每一次洗涤中,用离心机以3000r/min离心,7--8分钟,反复操作后,得到洗涤血红细胞,洗涤后的血红细胞在-15度下冷冻可保存半年并不影响产率和比活,在血液量大, 处理不完时必须这样做.
3.在洗净的红血球中加入等体积去离子水,剧烈搅拌30分钟,使红血球细胞壁砍碎,以使其内的SOD浸出.最好在0--4度静止过夜后,把溶血进行有机提取.
4.接着向溶血中缓缓加入0.2--0.25倍体积的预冷(-15度)95%乙醇和0.1--0.15倍预冷氯仿,搅拌10--15分钟后,原溶血呈浆糊状,静止1--2小时,用滤布除去凝固的血红蛋白,然后将滤液2500r/min离心约1--5分钟留上清液抛去沉淀, 此时如果上清液略为微黄色时,可用快速过滤纸过滤,可得到微带蓝色的清澈透明的粗酶液
(二)粗酶液的初步提纯:
1.丙酮提醇:向酶液中加0.8倍量预冷(-15度 ) 丙酮 , 生成大量白色沉淀 , 以3000r/min离心2分钟收集沉淀,上清液可不必吸取,直接倾倒.
2.热变性:(除杂蛋白)准备好衡温浴锅,在本工艺中,提前30分钟, 注满水接通电源后,使之加热到55--60度以省时间,将沉淀量约50倍量体积比加入0.2MPH=7.6磷酸钠缓冲溶液,水浴加热至60度,15分钟后迅速冷却到室温.3000r/min离心2 分钟得上清液,在上清液中,缓缓滴加0.6倍体积的预冷(-15度)丙酮,生成白色沉淀
3.初纯SOD:在上述沉淀中加去离子水,制成20--30%SOD溶液,分装入样品瓶中,放入冷冻干燥机中,于开机后以0.2--0.1Torr真空度,约1.5--2小时, 得到化妆或食品用SOD,该产品比活大于3000u/mg,外观呈微带蓝色的白色冻干品.
(三)SOD进一步提纯:
SOD精品一般是把SOD产品经过柱层析,柱层析后的SOD没有小分子等杂质, 层析后为高活性的SOD大分子.SOD精品价格更高,它主要作为生物化学试剂, 化验室标准试剂试用.目前SOD柱层析有两种,二者可单独使用,也可结合使用,一般是DEAE-- 纤维素层析和SephadcxG--100葡聚糖凝胶层析,将(二)2,热变性后SOD丙酮沉淀用PH7.6,0.2MNaH2PO4-NaHPO4缓冲溶液溶解,有不溶的杂蛋白时.离心抛去沉淀,上清液上DEAE--纤维素或SephadsxG--100层析柱(1*20cm或2.5*30cm),梯度洗脱 , 洗脱液为PH7.6,0.2M,NaH2PO4--NaHPO4缓冲液,下流速度控制在0.2--0.5ml/min,在分光光度计上用紫外谱325nm处测流出液,合并活力峰,再用蒸馏水反复透析,透析彻底后, 放入样品皿置于冷冻干燥机中干燥后即得SOD精品.
五.注意事项:
1.掌握适当的温度和时间:虽然SOD对热较稳定, 但在分离纯化过程中最好还是采用较低温度,一般以0--10度为宜,时间长不要超过3天.
2.注意提取,提纯方法:使用有机溶剂或者加热均能有效沉淀蛋白质, 但掌握适当溶剂和加热结合的办法可以达到最佳效果.
六.SOD的检测方法:活性检验,比较方便的办法是用连笨三酚自氧化法, 先测得连笨三酚的自氧化速率,然后加入SOD再测得加入SOD之后的氧化速率,按照酶活性单位定义,即在最佳条件下,每分钟抑制连笨三酚自氧化分解速率达50% 的酶量定义为一个酶单位.依次求出活力总值 ,同时也可以用聚丙烯酰胺凝胶电泳来测定其纯度,看其分子量32000左右的一条带是否与有关文献指导一致.
超氧化物岐化酶(superoxide dimutase 简称SOD)是一种重要的氧自由基清除剂，作为一种药用酶，引起国内外生化届和医药届的极大关注。SOD应用于医学临床上可以治疗多种疾病，类风湿性关节炎、心肌梗塞等，在防辐射，抗衰老，抗肿瘤等方面也有积极的作用，而且广泛用于化妆品和食品添加剂的行列。
自１９６９年Ｍccord和Ｆridovich 首次发现从牛血细胞中发现超氧化物岐化以来，到目前为止，国内已有几十家科研单位对SOD作了大量的研究和试产工作，而且有些已批量生产。SOD引起了国内生化界的重视，１９８８年在浙江宁波如开了《全国首届SOD学术会议》。1989年4月在河南开封《第三届药用酶学术会议》上，SOD被列为重点开发项目，90年7月在大连《全国第二届SOD学术会议》，SOD已作为一种药用酶发展较快，将成为一种很有前途的生化产物。
SOD是一种广泛存于动物、植物和微生物的生物酶，国外药用SOD系从血中提取，国内SOD已开发的品种已超过２０种，证明我国对SOD的研究和应用已进入新时期。
我国从牛、马、猪、鸡、狗等动物血中提取SOD来源丰富，成本低，提取和纯化较方便，药细胞膜易破，用常规分离纯化法可获得高纯度的SOD。
本技术采用热变性，超滤新技术，不仅大大简化了工艺过程，而且产品质量和收率都比老工艺有较大的提高，其提取的SOD均为ＣuＺu-SOD。
一、药品与仪器：
(１)柠檬酸三钠：Ｎa3Ｃ6Ｈ6Ｏ7 (２)工业丙酮ＣaＨ6Ｏ
(３)邻苯本酚 (４)酸磷钾Ｋ3Ｐoe4
(５)弱碱性阴离子交换剂ＤＥＡＥ Ｓephadsxa-50外观40-120ubrd或者ＤＥＡＥ-cell-ujose(ＤＥ-32)二乙基纤维素。 (６)冷冻干燥器(自己组配)
(７)层折柱(７.５＊３０cm) (８)离心机
以上试剂及其它药剂、仪器可在各省市化学试剂商店、医疗器械商店购买。
二、Ｃu、Ｚu-SOD的提取及纯化(牛、马血为例)
１、工业流程：
加抗凝剂 盐洗
鲜牛血--------------------->红血球------------------------>
离心除黄色血浆 加ＮaＣＬ
热变性１ 热变性２
压积红细胞-------------->淡黄色混合液--------------------->
68度30分钟 60-65度20分钟
加丙酮 加丙酮 层析
浅蓝色清液----------->絮状沉淀-------------->沉淀------------>
冻干
透析除盐
洗脱----------------->透析液--------->SOD(冻干品)
２、提取方法
(１)收集红细胞：鲜牛血１００升，加入３. ８％柠檬酸三钠抗凝剂搅拌均匀，静置，使红细胞自然沉降，除去上层大部分血浆，下层液再离心除尽其余血浆，再加入３倍量０.９％氯化钠(精制食盐)洗涤两次， 离心可收集到压积红细胞(４０升)。
(２)热变性１：收集的红细胞再加入４公斤氯化钠，４０克氯化铜，蒸馏水１００升搅匀，水浴加热到６８度恒温３０分钟，迅速冷却加至室温，过滤除沉淀，收集滤液。
(３)热变性２：滤液在６５度恒温水浴下，向滤液中慢慢中入４０克氯化铜，至滤液清澈变为淡蓝色为止，保温２０分钟，迅速冷却至室温，离心去沉淀得上清液。
(４)SOD粗品：超滤心清液加入０.７５倍全积的丙酮沉淀， 离心收集沉淀于离于水，离心除去不溶物得清液，清液加入０.７５倍体积的丙酮沉淀， 离心收集沉淀，沉淀经无水丙酮洗涤脱水两次，真空干燥得淡蓝色粉末状SOD粗品
(５)SOD粗品提纯：SOD粗品溶于２.５mmol/L，ＰＨ值７.６磷酸钾缓冲液，将该混合液上在７.５＊３０cm的层柱上，离子换剂为ＤＥＡＥ-ＳphadexＡ-５０(该柱事先用缓冲平衡)，以１００～２００ml/小时速度上样，完毕后用同一缓冲Ａ２８０mm值，低于０.０２然后用２５～２００mmol/L，ＰＨ值７.６磷酸钾缓冲液进行直线梯度分段洗脱，流速为１００ml/小时。用部分收集器收集， 洗脱液经透析除盐后，得浓缩的透析液，经冷冻干燥，得SOD成品，(呈浅绿色)。
三、SOD活性测定：
SOD的测定方法很多，常见的有化学法，免疫法等电点聚焦法等，化学法测定的原理主要是利用有些化合物如邻苯三酚，在自氧化过程中会产生有色中间物降超氧游离基(Ｏ２)这样就可以利用SOD分例(Ｏ２)。阻止中间物的积累而测定其酶活性。
１、试剂及仪器
(１)邻苯本酚分析纯，用１０mmol/LECL配成５０mmol/L溶液。
(２)ＵＶ－７５４紫外分光光度计。
２、测定方法：
(１)邻苯三酚自氧化速度的测定。
在２５度、４５ml`５０mmol/L、ＰＨ值８.３、Ｋ２ＨＰＯ４－ＫＨ２ＰＯ４缓冲液中加入１０mmol/L的邻苯三酚，迅速摇匀，倒入光径１cm的比色杯内，在３２５mm波长下每隔３０秒测Ａ值一次，要求自氧化速度控制在０.０７００d/mm 左右。
(２)SOD或粗酶抽提液活性测定：
测定方法同测邻苯三酚自氧化速度，在加入邻苯三酚前加入待测SOD样液，测得数据按以下公式计算酶活性。
０.０７００－Ａ３２５mm/min
----------------------------------------＊１００％度
０.７０
样液稀释倍数 样液稀释倍数
酶活性(u/m1)＝------------＊反应液总体积＊----------------
５０％ 样液体积
３、蛋白浓度(mg/ml)和蛋白的计算：
SOD或粗酶抽提液，经２８０mm紫外比色测定后，查牛轿清白蛋的标准曲线，由此算出每ml含ug蛋白的量。
蛋白浓度＝ug蛋白/ml＊样液稀释倍数＊１０负３次方＝mg蛋白/ml总蛋白＝mg蛋白/ml＊原液总体积＝mg蛋白。
４、比活(u/mg蛋白)的计算：
单位活力(u/ml) 总活力
比活＝-----------------------＝-----------------＝u/mg蛋白
蛋白的浓度(mg蛋白/ml) 总蛋白
四、Ｃu、Ｚn－SOD性质：
１、Ｃu、Ｚ n－SOD呈蓝绿色，分子量在３２００左右，由两个中一个Ｃu和一个Ｚn。
２、对热稳定，天然牛血SOD，７５度下加热数分钟其酶活丧失很小。
３、ＰＨ值对SOD的影响，SOD在ＰＨ５.３～１０.５范围内，其催化速度不受影响，ＰＨ３.６时SODＺn脱落９５％，ＰＨ１２SOD构象发生不可递的构象，导致酶活性丧失。
４、SOD的紫外线吸收特征：SOD在２８０mm处没有吸收高峰。
５、金属辅其与酶活性。SOD属金属酶Ｚn仅于分子结构有关，而Ｃu与催化活性有关。
６、SOD是其具有还有和失活作用的。
五、药品与仪器：
柠檬三钠，分析纯：江苏花桥北工四厂；
工业丙酮：上海溶剂厂；
邻苯三酚，分析纯：贵州遵义化工厂；
六、SOD的包销单位：