造血干细胞检查方法及流程

造血干细胞检查方法及流程: 检查方法及流程; 的检测方法：由于具有自我更新和多向分化这两个基本特点，所以在判定时必须同时满足这两个条件，需要所用的方法能够同时反映这两个指标。体内长期多系重建造血研究噬判断造血干细胞最直接、最可靠的方法，对动物较为方便，而对人造血干细胞的研究则在很大程度上需要通过体外测试间接反映。目前主要通过功能实验来检测造血干细胞。脾结节形成单位（CFU-S）测定法只适用于啮齿类动物。是检测小鼠造血干细胞的经典方法。其测定小鼠造血干细胞在脾脏定居和形成集落的能力。给受致死剂量照射的小鼠输入同种骨髓细胞，在第8天和第14天计数小鼠脾脏表面的集落。每一个集落均是由一个造血干细胞增殖分化来的，而且输入的骨髓细胞数与生成的脾结节具有良好的线性关系。通常第14天的CFU-S比第8天更原始。长期重建实验和骨髓再植测试长期重建实验（long-term trpopulating/reconstituting assay，LTRA）和骨髓再植测试（marrow repopulating assay，MRA）是将造血干细胞输注给受致死剂量照射的小鼠或SCID小鼠，观察各系的长期造血重建或骨髓再植重建髓系造血的情况。具有长期多系造血重建能力的细胞成为长期重建细胞LTRC，而具有定居于受照小鼠骨髓并重建髓系造血能力的细胞称为骨髓再植能力细胞，其比LTRC成熟但早于12天的CFU-S。有实验证实，LTRC是一种比CFU-S更早的造血干细胞。由于人的造血干细胞可植入SCID小鼠，所以用SCID小鼠移植通常用来检测人的造血干细胞。但其对检测人的造血干细胞活性存在一些限制，因这些小鼠在12个月内死亡而是长期观察及次级移植实验有一定难度。另外，其淋巴器官缺陷，在SCID小鼠体内人造血细胞向淋巴系分化受到影响。由于这些限制，确切地将这种细胞称为SCID小鼠再植细胞（SCID repopulating cell，SRC）。如果在SCID小鼠体内植入人的胚胎期胸腺组织制成SCID-hu模型后再进行造血干细胞的移植，便可以弥补SCID小鼠不能观察淋巴系造血重建的缺陷。胎羊宫内移植模型在人造血干细胞检测的动物模型中，最为可靠的是绵羊子宫内胎羊移植系统。该系统是在胎羊免疫系统发育前于子宫内将人的造血细胞植入绵羊的胚胎，在绵羊出生后，通过追踪其体内人的造血细胞及其各系的分布来判断移植的细胞是否具有长期重建多系造血的能力。这一系统不仅能进行长期观察，而且可进行次级受者移植研究。竞争性再植实验（competitive repopulating assay）是一种相对定量检测LTRC的方法，它是将带有不同遗传学标志的两种造血干细胞同时输注给经致死剂量照射的小鼠，在这种情况下，那种成熟细胞含量高或造血干细胞存在某种缺陷的群体将会受到抑制，从而观察不同来源造血干细胞的长期造血重建能力的差别以及某些因素对造血干细胞造血重建能力的影响。这种具有长期重建造血能力的细胞称为竞争性再植单位（CRU）体外克隆实验通过模拟体内的造血环境和造血过程可在体外观察造血干细胞的增殖和分化，从而判断细胞是否具有产生造血祖细胞并分化为多个造血细胞系的能力，进而间接反映造血干细胞的存在。目前用来检造血干细胞和早期造血祖细胞得体外克隆实验包括：长期培养启动细胞LIC-IC实验 long-term culture initiating cells, LTC-IC延长的长期培养启动细胞LIC-IC实验 extended long-term culture initiating cells, LTC-IC高增殖潜能集落形成细胞实验HPP-CFC high proliferative potential colony forming cell, HPP-CFC卵石样区域形成细胞实验CAFC cobblestone area-forming cell, CAFC原始细胞集落形成细胞测试CFC-BI, blast colony forming cell, CFC-BI混合集落培养法CFU-Mix，colony forming unit-mix, colony forming unit-granulocyte, eythrocyte, macrophage ,megakaryocyte, CFU-GEMM LIC-IC是指在骨髓基质细胞的支持下生长35-60天所产生的集落称为LTC-ICELTC-IC是指生长60-100天所产生的集落称为ELTC-ICHPP-CFC是指在体外半固体培养10-12天后形成的大集落，其在体内对细胞毒药物5-FU不敏感，具有向髓系和淋巴系分化的潜能，对多种细胞因子有反应性。通常认为其比LTRC更成熟，相当于第28天的CAFC和MRA。CAFC是一种基于Dexter体系的微型基质依赖骨髓培养法，它是将骨髓细胞接种于受致死剂量照射的基质细胞层上培养10-28天，观察卵石样造血区域形成情况。CFC-BI是一种早期造血细胞，其在体外适当的条件下半固体培养18-32天后，形成由形态上未分化细胞组成的小集落（大于25个细胞）。这种细胞具有高度再克隆能力和自我更新潜能，并有生多系定向祖细胞的能力，其在分化程度上相当于HPP-CFC或更早。CFU-Mix是半固体培养12-16天后形成的含有粒、红、巨噬和巨核多个造血细胞系列的集落。这些细胞大致相当于较晚期的CFU-S，比LTRC成熟。虽然各种体外实验可部分反映造血干细胞的情况，但当前的各种体外检测方法均无法观察造血干细胞向淋巴系的分化，即无法判断这些细胞是否具有全系造血能力，因此至今仍没有一个体外培养方法可用检测造血干细胞。造血祖细胞造血祖细胞阶段的细胞全部或部分丧失造血干细胞所具有的自我更新和自我维持能力，同时逐步限制了多向分化的能力。造血祖细胞可分为：多向性祖细胞：具有多向分化能力（早期祖细胞）；定向祖细胞：向特定系分化（晚期）：红系、粒-巨噬系、巨核系、淋巴系。早期祖细胞的标志为CD33、CD38、HLA-DR、CD45RO阳性；系特异性抗原：粒CD11、13、15、16等；单核系：CD14；B淋巴系：CD19、20、21、22；T/NK系：CD2、7、11、25、56；红系：CD36、47、59、71；巨核系：CD31、41、42、61、63、107等。多向性祖细胞：multipotential progenitor，CFU-Mix是一类在性能上类似CFU-S的细胞群体，是CFU-S的直接后代，是最早期的造血祖细胞。含4-5系的混合集落源自此多向性祖细胞，即每个混合集落由一个多向性祖细胞分化增殖而成。多向性祖细胞已表达Ia抗原，且自我更新能力有限，因此有别于多能造血干细胞。红系祖细胞：早期红系祖细胞burst forming unit-erythroid，BFU-E；晚期红系祖细胞colony forming unit-erythroid，CFU-E。BFU-E是唯一定向朝红系分化的最早祖细胞，由骨髓造血干细胞（CFU-S）或多向祖细胞（CFU-GEMM）产生。BFU-E绝大部分处于静止期，仅30-40%处于细胞周期中，可认为BFU-E代表红细胞的储备。外周血BFU-E同骨髓中的BFU-E相比，主要为更早期的处于静止期的细胞。体外培养人的骨髓细胞，BFU-E集落一般14-16天达峰值。BFU-E增殖的正性调节因子主要包括IL-3、EPO、GM-CSF等。负性调节因子包括TGF-b、IFN-g等。CFU-E是一类比较分化的祖细胞，大部分细胞60-80%处于细胞周期中。体外培养7天，在EPO作用下，产生集落。CFU-E集落比BFU-E小，对EPO敏感。粒-巨噬系祖细胞：分别由粒细胞集落形成单位（colony forming unit-granulocyte，CFU-G）、单核-巨噬细胞集落形成单位（colony forming unit-monocyte marophage，CFU-MM）、粒-巨噬细胞集落形成单位（colony forming unit-granulocyte marophage，CFU-GM）。在上述体外培养条件下形成的集落也是起源于单一细胞，这种细胞就是粒-巨噬系祖细胞（granulocyte progenitor）与单核-巨噬系祖细胞（monocyte marophgae progenitor）。在体外培养中使用不同条件培养液，或加入不同集落刺激因子可改变CFU-GM三种集落的比例和产率。CFU-GM增殖的正性调节因子主要是集落刺激因子，如IL-3、GM-CSF、G-CSF、M-CSF等。巨核系祖细胞（colony-forming unit-megakaryocyte，CFU-Mega）是一个独特的系，来自造血干细胞。在它的发育过程中包含了造血系统中最小和最大体积的细胞。血小板是直径仅1-2mm的无核细胞，而骨髓巨核细胞却是直径大于20mm的多倍体细胞。用半固体培养基在体外培养出的巨核系祖细胞，由于其集落中出现的早期和晚期细胞不同，可分为三类祖细胞。爆式巨核细胞形成单位（burst forming unit-megakaryocyte, BFU- Mega）类似BFU-E，是最原始的巨核祖细胞，具有很高的增殖潜能。由多个巨核细胞丛组成的集落可含有数百个巨核细胞，为含巨核细胞数最多的集落。体外培养生成集落所需时间长，小鼠12天，人21天。巨核细胞集落形成单位（colony-forming unit-megakaryocyte，CFU-Mega）类似CFU-E，是较成熟的巨核祖细胞，也是最先发现证实的巨核祖细胞。每个集落含巨核细胞数较少。体外培养生成集落所需时间短，小鼠5天，人12天。低密度巨核细胞集落形成单位（ light-density colony-forming unit-megakaryocyte，LD-CFU-Mega）类似CFU-E，是最成熟的巨核祖细胞，仅有很低的增殖能力，是由高倍体细胞组成的小集落。CFU-Mega 增殖的正性调节因子主要是TPO 、IL-1、3、6、11、GM-CSF、EPO、SCF、G-CSF等。淋巴系祖细胞T淋巴祖细胞CFU-TL培养方法是将正常人外周血经密度梯度离心分离后，收集单个核细胞，再纯化T淋巴细胞。用甲基纤维素或琼脂法培养7天，可生成由T淋巴祖细胞集落。一般培养后3天检查，集落细胞呈原始淋巴细胞外观，第7天即呈小淋巴细胞外观。其来源是多克隆性的。B淋巴祖细胞小鼠脾脏或淋巴细胞等在含有巯基乙醇的体外培养基可生成B淋巴细胞集落或B淋巴细胞集落形成单位colony forming unit-B lymphocyte，CFU-BL。如在上述培养体系加入适量胎牛血清和羊红细胞或那毒素，则集落形成数与接种的有核细胞数之间呈良好的先行关系。正常人外周血经密度梯度离心分离后，收集单个核细胞，再分离B淋巴细胞。用甲基县纤维素或软琼脂法培养7天，一般培养后3天检查，集落细胞呈原始淋巴细胞外观，第7天即呈浆细胞外观。