- 请问：谁知道洁净手术室做空气细菌数监测时，采样器皿的摆放位置，时?
- 我院新建了洁净手术室，不知道怎么做监测，就是对它的空气细菌指数的监测。
另外还想知道作为院感人员对洁净手术室都要进行那些常规的数据监测，如何做？ 有大侠能细说之将不胜感谢。
- 一、消毒灭菌效果监测：
1.必要性：
①消毒灭菌效果监测方法专业性强，不检验不知道结果；
②新建病房、新消毒设备、新消毒剂均应做效果监测。
③特殊对象、特殊需要，必做效果监测。如移植术前、ICU病房、危重病人等。
2.科学性：以科学的试验设计、熟练的技术、可靠的结果、确切地分析，得出结果评价。
3.规范性：以权威规范为依据，符合其基本原则要求。如检测时机的确定、标准菌株的选择、标本数、重复次数、实验方法等确立。
二、监测方法的分类：
1、根据检测方法性质分：
①物理方法：测量压力灭菌温度、测量紫外线强度等；
②化学方法：各种化学指示卡；
③生物方法：嗜热/枯草芽孢灭菌效果监测自然菌存活数监测；
2、根据消毒灭菌对象性质分：
①空气消毒：
②表面消毒：
3.根据具体消毒对象分：
①压力蒸汽灭菌：
②各种器械：
③化学消毒剂：
④紫外线灯杀菌效果：
⑤手和皮肤消毒效果：
⑥空气消毒效果：
⑦物体表面消毒效果：
三、必要条件：
1、专业实验室：
2、必备设备器材：
3、选择实验方法：
4、熟练实验技术：
四、卫生部对500张床位以上医院感染管理的质量指标规定：
（1）医院感染率≤10%；灭菌切口感染 ≤0.5%
（2）医院感染的漏报率≤20%；
调查样本量不少于年监测病人数的10%
（3）医院必须对消毒、灭菌效果定期进行监测。
灭菌合格率必须达到100%
（4）使用中的消毒剂、灭菌剂应进行生物和化学监测。消毒剂每季度生物监测1次，细菌含量必须<100cfu/ml，不得检出致病微生物；灭菌剂每月检测1次，不得检出微生物。化学监测应根据消毒、灭菌剂的性能定期监测。
（5）压力蒸气灭菌进行工艺、化学和生物监测。环氧乙烷必须每锅进行工艺监测，每包进行化学监测，每月进行生物监测。压力蒸气锅每天第一锅必须做B-D试验。
（6）紫外线灯强度监测：每季度1次；新灯管30W≥90µW/cm2,旧灯管≥70µW/cm2
（7）胃肠镜等诊疗器材消毒标准不得检出致病微生物；腹腔镜、关节镜等应灭菌处理，不得检出任何微生物。
（8）进入人体组织、血液、器官的医疗用品应灭菌处理，不得检出致病微生物；接触黏膜医疗用品细菌总数≤20cfu/g（或100 cm2）；接触皮肤的医疗用品细菌总数≤200cfu/g（或100 cm2），不得检出致病微生物。
（9）母婴同室、婴儿室物体表面和医护人员手不得检出沙门氏菌。
（10）医院各类环境空气、物体表面、医护人员手细菌数标准：
环境 类 别 空气 物体表面 医护人员手
cfu/cm3 cfu/cm2 cfu/cm2
Ⅰ类 层流洁净手术室、 ≤10 ≤5 ≤5
洁净病房
Ⅱ类 普通手术室、产房、 ≤200 ≤5 ≤5
婴儿室、普通隔离病房
Ⅲ类 儿科、妇科检查室、 ≤500 ≤10 ≤10
注射、换药、治疗、
急诊、化验、普通病房
Ⅳ类 传染病科及病房 —— ≤15 ≤15
五、为保证医院消毒灭菌可靠，应认真做好医院消毒灭菌效果监测
1、影响消毒灭菌因素很多，使消毒灭菌效果难以保证。
2、消毒灭菌效果生物监测专业性强，条件难创造，结果评价难度大，实验周期长。
3、化学测试试剂法较复杂，结果准确；试纸法简便易行，但精确度较差。
六、压力蒸汽灭菌效果的监测：
（一）BD试纸：
检查灭菌器工艺状态，并不能反应灭菌器使用中被灭菌物品的实际灭菌效果。发现阳性应进行灭菌器性能检查调试。
（二）指示胶带：
表示是否经过灭菌处理，并不能反应被灭菌物品实际灭菌效果。
（三）化学指示卡：
检测每包被灭菌物品的灭菌效果。建议最好每包被灭菌物品中心放一片化学指示卡,待灭菌处理后,视其变色程度（灭菌效果）决定是否使用。
（四）用生物指示剂作系统监测：
采用生物灭菌指示剂来检查压力蒸汽灭菌效果是最科学、最可靠的监测方法。由中国预防医学科学院流行病微生物研究所，北京鑫四环消毒技术开发中心联合产销的嗜热脂肪杆菌芽孢（SS1，K31）是国际公认的标准菌株。现制成标准菌片，供检查压力蒸汽灭菌效果检测。
w 菌株特点：
1、 该菌为需氧芽孢杆菌，细菌繁殖体G兰氏染色阴性呈紫色，细菌芽胞孔雀绿着色。其细菌繁殖体对培养基要求低，在溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨琼脂上生长良好，表面粗糙呈米黄色。
2、最适生长繁殖温度为56–65℃，培养24h即可形成菌落，37℃下24h看不到菌落。
3、 本生物指示剂载体为高级滤纸片，染菌量为5×105–106cfu/片，封装在小纸袋内，热死亡时间为121℃，3.9min阳性，19min阴性；D10值1.3–1.9min，符合美国药典第十一版规定标准。该菌无毒，热抗稳定，在冰箱内4℃下保存一年抗力无明显下降，在常温（20℃左右）可保存1个月。
w 使用方法：
1、 该芽孢菌片使用时将装有菌片的小纸袋放在被灭菌的物品中心部位（每锅放置菌片数按卫生部规定）。
2、 灭菌后，再无菌操作下取出小纸袋中的菌片， 投放到溴甲酚紫培养液管中。同时将未经灭菌的菌片投入另一管培养基中作对照。
3、 56℃–60℃培养，48h观察结果，对照管为米黄色；若灭菌后菌片培养液颜色不变仍为淡紫色，为阴性（–），表示灭菌彻底；如变黄为阳性（+），表示灭菌不彻底。
w 培养基成分和配制方法：
1、成分：胰蛋白胨10g、葡萄糖5g、蒸馏水 1000ml、1.6%溴甲酚紫酒精溶液指示剂1ml。
2、配制方法：
（1）1.6g溴甲酚紫溶于98.4ml的96%酒精溶液中摇匀；
（2）把前三种成分溶解后，调解pH7.0-7.2，加入指示剂摇匀；
（3）每管分装5ml，以121℃20min灭菌后，放4℃冰箱内保存，备用。
w 注意事项：
1、防止指示剂中酒精挥发而使溴甲酚紫含量过高（溴甲酚紫含量过高后可抑菌生长）；
2、菌片灭菌后应及时取出培养；
3、禁止菌片接触任何消毒剂及放射源以免影响抗力。
七、化学消毒剂消毒效果监测：
（一）消毒剂有效含量的测试：
1、主要是有效含量不稳定的消毒剂，如过氧 乙酸、含氯消毒剂等应进行含量测试。
2、 化学试剂滴定法较复杂但结果精确；试纸法方便快速，但准确性差。专用测氯试纸——比较准确；复合测试试纸（可同测过氧乙酸、含氯消毒剂）——准确性较差。戊二醛试纸；含碘、臭氧等试纸尚待研究。
（二）化学消毒剂使用溶液污染菌数的检测
1、选好用好中和剂：
2、做到：对应，浓度、比例合适
3、 中和剂选择原则：
①本身对菌无影响
②确能去除杀菌因子
③生成物对菌无影响
④对照完全
★ 试验分组：
① 菌液+药液 培养
②（药+菌液）+中和剂 培养
③ 中和剂+菌液 培养
④（药+中和剂）+菌液 培养
⑤ PBS+菌液 培养
⑥ PBS 培养
⑦ 中和剂 培养
⑧ 培养基 培养
1）方法：
第一步： 用容量为1ml的灭菌吸管，吸取1ml消毒溶液。
第二步：将吸取的1ml样液加入到9ml的稀释液中，这个稀释液的配制成分取决于消毒剂溶液的成分，即在生理盐水溶液中加入合适的中和剂。
浸泡器械用消毒液缸 稀释管 营养琼脂平皿
图1 Kelsey和Maurer提出消毒剂溶液在使用过程中的试验
第三步：
将上述消毒稀释液试管送到实验室，从采样到试验时间不要超过1h，随后用一支50滴/ml量的滴管 (出可用有0.02ml刻度的血清吸管），吸取混合液，在每一个营养琼脂平板表面上（培养基平板表面上已无水分），滴10滴（每滴量为0.02ml），同样滴二个平板。
第四步：
将二个平板分别孵育于二种不同温度的孵箱内；一个放在37℃孵箱内1～2天；另一个平板孵育于20℃左右的室温下3～7天，随后计算二个平板上的菌落数，除以2，即得出每个平板上的平均菌落数。
2）试验结果：
平板培养后有细菌菌落存在，表示消毒溶液中有细菌存在。若一个板上长1～2个菌落，可以忽略，因为消毒剂溶液毕竟是一种化学消毒剂，而不是灭菌剂，因此培养出极少量活菌是属正常。若一个平板上生长5个或5个以上的菌落，则应注意这消毒剂溶液已被污染。从平板上检出菌落数，可以计算出每毫升消毒溶液中存在的细菌数，其计算方法如下：
◆ 由于消毒样液是按1：10稀释，用50滴/ml的滴管滴10滴。如果10滴的消毒剂/稀释液混合液生长了5个菌落，可计算出1ml消毒溶液中存在250个活菌。换句话说，在一个板上滴上10滴，它是1ml的1/5，因此计算如下：
5（一个平板上长菌落总数）×10（用消毒液稀释10倍）×5（在平板滴10滴，只占消毒剂/稀释液混合液的1/5）=250个菌。
5×10×1=100个菌，即每毫升消毒液中存在的细菌数。若一个平板上长20个菌落，则每毫升消毒液中有5×10×5=250个细菌，这样多的细菌，说明此消毒剂溶液已经失效，不能再使用
（见图2）
图2 平板上细菌的污染情况
每滴上各有少数菌落表示不能继续使用
每滴上存在许多菌落表示严重污染
3）消毒剂溶液中长菌的原因:
消毒剂溶液中长菌，常见有下列几种原因：
①容器没有洗净，未经加热消毒处理。
②配制消毒剂溶液时，消毒剂和水量不准确， 使消毒浓度过低不能杀死细菌或抑制细菌。
③消毒剂溶液贮存过久，已经失效。
④由于过多的有机物质在消毒剂溶液中，消耗消毒剂而使消毒剂失效。
⑤在消毒剂溶液中存在着各种抑制消毒剂物质。
八、医疗器械灭菌效果的检测：
采样时间；在灭菌处理后，存放有效期内采样。
（一）常规监测
1、检测方法：缝合针、针头、手术刀片等件医疗器械各5件，分别投入5ml的无菌洗脱液中。注射器则取5副在5ml无菌肉汤中分别抽吸5次。手术钳、镊子等大的医疗器械取2件，用棉拭子反复涂擦采样，将棉拭子投入5ml无菌洗脱液中。振打80次,吸取1ml 接种平皿做活菌计数， 37℃培养48h，计算菌落数。
2、结果判定：平板上无菌生长为灭菌合格。
3、注意事项：若消毒因子为化学消毒剂时，
采样液中应加入相应的中和剂。
（二）无菌检验
1、无菌检验前准备
（1）洗脱液与培养基无菌检验：无菌试验前3天，于需-厌氧培养基中各接种1ml 洗脱液，分别至30~35℃与20~25℃培养72h，应无菌生长。
（2）阳性对照管菌液制备：试验前一天取金黄色葡萄球菌（CMCC 26003）新鲜培养物，接种1环至需-厌氧培养基内，在30~35℃培养16~18h，用0.9％无菌氯化钠溶液稀释10cfu/ml备用。取生孢梭菌（CMCC 6494）的需氧菌、厌氧菌培养基新鲜培养物1环接种于相同培养基内，30~35℃培养16~18h，用0.9％无菌氯化钠溶液稀释10cfu/ml备用。取白色念珠菌（CMCC 98001）真菌琼脂培养基斜面新鲜培养物1环，接种于相同培养基内，20~25℃培养24h，用0.9％无菌氯化钠溶液稀释10cfu/ml~10cfu/ml备用。
2、无菌操作：
（1）取缝合针、针头、刀片等小件医疗器械5件直 接侵入6管需--厌氧培养管（其中1管作阳性对照）与4管霉菌培养管。培养基用量为15ml/管。
（2）取5副注射器，在5ml洗脱液中反复抽吸5次， 接种需-厌氧培养管（6管，其中1管作阳性对照）与霉菌培养管（共4管）。接种量：1ml注射器为0.5ml，2ml注射器为1ml，5~10ml注射器为2ml，20~50ml注射器为5ml，培养 基用量为2ml以下为15ml/管，接种量5ml为40ml/管。
（3）手术钳、镊子等大件医疗器械取2件用棉拭子涂擦采样，投入5ml无菌洗脱液中，接种于需-厌氧培养管（6管，其中1管作阳性对照）与霉菌培养管（共4管）。接种量为1ml/管，培养基用量为15ml/管。
3、培养：将需-厌氧培养管以及阳性与阴性对照管均于30～35℃培养5天。霉菌培养 管与阴性对照管于20～25℃培养7天。
4、结果判定：阳性对照在24h内应有菌生长，阴性对照无菌生长，需-厌氧培养管及霉菌培养管无菌生长，可判为灭菌合格。
★ 如需-厌氧培养管及霉菌培养管中任何1管显混浊并证明有菌生长，应重新取样，分别复测2次，如各管无菌生长仍可判为灭菌合格。
5、注意事项：
（1）在洁净度100级区域中进行，严格无菌操作。
（2）采样后送检时间不得超过6h，样品保存于4℃，则不超过24h。
（3）如消毒因子为消毒剂，采样液中应加入中和剂。
（4）采样面积，100cm2。
（5）设好阳性、阴性对照。
九、手和皮肤消毒效果检测：
1、采样时间，在消毒后立即采样。
2、采样方法
（1）手，手曲面手指跟到手指端（一只手约30cm2），采样液10ml。
（2）皮肤，5cm×5cm 。采样液10ml。
3、检验方法
取1ml采样液做活菌计数，37℃培养48h。
4、采样结果计算：
平板上菌落数 X 稀释倍数
细菌总数（cfu/cm2）= ---------------------------------
采样面积（cm2）
5、结果判定：
（1）I、II类区域工作人员，细菌总数 ≤5cfu/cm2，并未检出致病菌为消毒合格。
（2）III类区域工作人员，细菌总数≤10cfu/cm2，并未检出致病菌为消毒合格。
（3）IV类区域工作人员，细菌总数≤15cfu/cm2，并未检出致病菌为消毒合格。
●母婴同室、婴儿室、新生儿室及儿科病房的工作人员，不得检出沙门氏菌及其他致病菌。
6、注意事项：
（1）采样器材应无菌。
（2）采样液中应含相应的中和剂。
（3）阳性对照的设定问题。
（4）消毒时间要求，外科手消毒3分钟、卫生手消毒1分钟，皮肤消毒5分钟。
十、物体表面消毒效果监测
1、采样时间：消毒处理后采样。
2、采样方法
用5cm×5cm灭菌规格板，采样面积≥100 cm2。门把手等不规则表面直接用棉拭子采样。
3、采样液10ml（含中和剂）。
4、检验方法：同上
5、结果判定：
（1）I、II类区域，细菌总数≤5cfu/cm2，并未检出致病菌为消毒合格。
（2）III类区域，细菌总数≤10cfu/cm2，并未检出致病菌为消毒合格。
（3）IV类区域，细菌总数≤15cfu/cm2，并未检出致病菌为消毒合格。母婴同室、婴儿室、新生儿室及儿科病房的物体表面，不得检出沙门氏菌。
十一、空气消毒效果监测
1、采样时间：消毒后、操作前进行采样。
2、采样方法：
（1）布点：
室内面积≤30 m2，设内、中、外对角线3点，内外点距墙1m；室内面积 >30 m2，设四角及中央5点，四角点距墙1m。
（2）平板暴露法
平板直径9cm、采样高度1.5m，暴露5min。
3、检验方法
平板37℃培养48h。计数菌落数并分离致病菌。
4、平板暴露法结果计算
50000N
细菌总数（cfu/m3）= --------------------
A×T
A为平板面积（cm2）； T 为暴露时间（min）；N 为平均菌落数（cfu）
5、结果判定
（1）I、II类区域，细菌总数≤10cfu/cm3，并未检出致病菌为消毒合格。
（2）III类区域，细菌总数≤200cfu/cm3，并未检出致病菌为消毒合格。
（3）IV类区域，细菌总数≤500cfu/cm2，并未检出致病菌为消毒合格。
6、注意事项：采样前关好门窗，在无人走动的情况下，静止10min 进行采样。
十二、紫外线灯管强度的检测：
1、紫外线是不可见光，紫光≠杀菌。
2、紫外线直射、折射。
3、紫外线穿透力弱。
4、杀菌紫外线为C波段，中心波长2537AO
5、紫外线杀菌剂量：强度 X 时间
6、检测紫外线灯管强度的方法：紫外线强度仪；紫外线强度指示卡
7、紫外线灯管的质量：玻璃无气泡、气线；启动快；不闪动；寿命长；照射强度标准：30W灯管新灯≥90µW/cm2；旧灯≥70µW/cm2
8、紫外线强度测试距灯光垂直100cm照射直接读强度值。
注意：①作好防护：戴眼镜、手套，必要时戴防护面罩。
②紫外灯管开启后稳定5分钟后，读测试数值。
③紫外线强度变化与灯管质量电压，反光罩光洁度等有关。
十三、几点信息和看法：
1、对消毒技术和方法的评价问题：
1）含氯消毒剂的更替；
2）戊二醛和邻苯二甲醛；
3）动态消毒机的效果评价；
4）臭氧消毒的优缺点(氧化作用突出)；
5）空气和表面消毒相结合；
◆消毒是积极的治疗，对任何人都是必不可少的！
◆健康的生命才是最宝贵的！
◆为了保护健康和生命，让我们共同为发展消毒事业而努力！
空气细菌数监测比较(CFU／m3)